كلياتي در مورد روش‌هاي مطالعه بندپايان مهم پزشكي در شرايط آزمايشگاهي و صحرايي
۱- جمع‌آوري، نگهداري و كار با نمونه
هر متخصص حشره‌شناسي پزشكي، در حين انجام تحقيقات صحرايي مجبور به صيد كردن نمونه‌ها و كار با آنهاست. اين كار معمولاً شامل جمع‌آوري و نگهداري نمونه‌ها با روش‌هاي خاصي است كه عمدتاً، و گاهي اوقات تنها روش‌هايي هستند كه براي مطالعه گروه خاصي از بندپايان به كار مي‌روند. اين روش‌ها براي گروههاي مختلف حشرات مهم پزشكي و همچنين در نقاط مختلف، متفاوت هستند. بنابراين، در ذيل به شرح برخي از نكات اساسي در اين مورد مي‌پردازيم و روش‌هاي تخصصي در فصل مربوط به هر گروه ارائه گرديده است.
اصول جمع‌آوري نمونه و كار با آن
لوازم جمع‌آوري
اين وسايل از ساده‌ترين ابزار، از قبيل توري‌هاي حشره‌شناسي و لوله‌هاي صيد، تا تله هاي بسيار تخصصي كه براي اهداف خاصي به كار مي‌رود، متفاوتند. نمونه‌گيري عبارتست از جمع‌آوري نمونه‌ها با يك روش استاندارد به منظور انجام مطالعه كمّي، كه در آن مي‌توان از ابزار بسيار متفاوتي استفاده نمود. در اين قسمت فقط برخي از نكات ساده و اساسي كه به صورت روتين مورد استفاده بوده و براي صيد لازم هستند، مورد بررسي قرار گرفته‌اند. انواع مختلف تله‌ها براي صيد حشرات به منظور انجام تحقيقات خاص به كار رفته‌اند. برخي از آنها حشرات را به صورت انفرادي و از طريق مكانيكي به دام مي‌اندازند مثل تله‌هاي مكنده)، در حاليكه سايرين با استفاده از مواد جلب كننده از قبيل نور، دي‌اكسيدكربن و يا بوي بدن ميزبان آنها را صيد مي‌كنند.
توري‌هاي حشره گيری دستي معمولاً شامل يك كيسه ساخته شده از توري‌هاي داراي سوراخ‌هاي ريز هستند كه به دور يك قاب دايره‌اي متصل گرديده است. اين قاب از جنس آلومينيوم بوده و طوري طراحي شده كه مي‌توان در موقع عدم استفاده، آن را از هم جدا نمود. به دليل ريز بودن جثه اكثر حشرات و بندپايان مهم پزشكي، توري‌ها معمولاً در حشره‌شناسي پزشكي ارزش محدودي دارند. با وجود اين، در مورد جمع‌آوري پشه‌ها از طريق حركت جارويي بر روي رويش گياهي و صيد مگس‌هاي تسه‌تسه از روي ميزبانهايشان، از آنها استفاده مي‌شود. هدف صيد، مشخص كننده نوع مناسب توري است. در مورد حشرات مهم پزشكي، كار با كيسه‌هاي توري سفيد راحت تر است، در حالي كه براي جمع‌آوري پروانه‌ها توري سياه طرفدار بيشتري دارد.
وسيله جمع‌آوري مهم ديگر در حشره‌شناسي پزشكي، آسپيراتور است. اين وسيله كه انواع مختلفي هم دارد، براي جمع‌آوري پشه‌ها و پشه‌خاكي‌ها از اماكن استراحتشان و حتي براي جمع‌آوري اكتوپارازيت‌هايي كه وادار به ترك ميزبانهايشان مي‌شوند، مورد استفاده قرار مي‌گيرد.
آسپيراتورها وسايل ساده، ولي مؤثري هستند كه حشرات كوچك را از طريق مكيدن به داخل، صيد مي‌كنند. عمل مكش هوا هم توسط دهان فرد جمع‌آوري كننده و هم با وسايل حبابي شكل پلاستيكي صورت مي‌گيرد. در برخي موارد هم فَن‌هاي كوچكي كه با نيروي باتري كار مي‌كنند، اين عمل را به عهده دارند. ساده‌ترين نوع آسپيراتور، يك لوله شيشه‌اي يا پلاستيكي شفاف به طول حدود 25 سانتيمتر است كه يك توري بر روي يك انتهاي آن قرار گرفته و بر روي توري يك لوله بلند قابل انعطاف متصل شده است. انتهاي ديگر لوله پلاستيكي قابل انعطاف در دهان فرد جمع‌آوري كننده قرار مي‌گيرد و با عمل مكش هوا، حشرات را مي‌توان به سادگي درون لوله شيشه‌اي كشيد.
نوع ديگر آسپيراتور داراي يك قسمت شيشه‌اي يا لوله پلاستيكي به طول حدود 15-10 سانتيمتر است كه دو انتهاي آن توسط يك درپوش مسدود شده‌اند. يك لوله شيشه‌اي باريك كه در هر دو انتها باز است از اين درپوش عبور داده مي‌شود. در كنار اين لوله يك لوله پلاستيكي وجود دارد و حشرات از طريق انتهاي لوله باريك ديگري وارد محفظه مي‌شوند. يك تكه توري كه روي انتهاي داخلي لوله مكش قرار دارد، جلوي ورود نمونه‌ها را از محفظه به داخل حلق فرد جمع‌آوري كننده مي‌گيرد.
بسياري از حشرات مهم پزشكي را مي‌توان حتي بدون استفاده از توري يا آسپيراتور و از طريق قرار دادن يك لوله آزمايش بدون لبه بر روي آنها كه در حال استراحت يا خونخواري هستند، صيد نمود. لوله‌ها يا ويال‌هاي داراي اندازه و شكل مختلف براي اين كار مناسب هستند.
حشرات كوچك مثل پشه‌خاكي‌ها و ميدج‌هاي Culocoides را مي‌توان از طريق الكتريسيته ساكن كه در لوله‌هاي پلاستيكي ايجاد مي‌شود، به آنها چسباند و جمع‌آوري نمود؛ به ويژه اين كار را مي‌توان با لوله‌هاي ساخته شده از جنس پلي استيرن شفاف به خوبي انجام داد.
كشتن و نگهداري نمونه‌ها
مهمترين نكته‌اي كه بايد در حين كشتن و نگهداري نمونه مد نظر داشت، ويژگي‌هايي است كه براي تشخيص آن به كار مي‌روند. عدم توجه به اين نكته در هر يك از مراحل اوليه مي‌تواند تعداد زيادي از نمونه‌هايي را كه به دقت جمع‌آوري شده‌اند، غير قابل استفاده سازد. به عنوان مثال، پشه‌ها نبايد در مايعات نگهداري شوند و يا توسط آنها جمع‌آوري گردند؛ زيرا فلس‌هايي را كه بدن و بال‌هايشان را پوشانده از دست خواهند داد و اين كار، تشخيص آنها را تقريباً غير ممكن مي‌سازد. همچنين كيفيت نمونه در بسياري از حشرات و ساير بندپايان در صورتي كه گذاشته شوند تا بميرند، پايين خواهد آمد. براي شناسايي يا ذخيره طولاني مدت به صورت نمونه‌هاي مورد استفاده در شناسايي ساير نمونه‌ها (نمونه‌هاي مرجع)، بايد آنها را از طريق تماس دادن با يكي از تركيبات كشندة استاندارد، كشت. اين مواد شامل استات اتيل، اتر، تتراكلرواتان و كلروفرم هستند كه مي‌توان آنها را روي يك تكه پنبه ريخت و پنبه آغشته را به همراه نمونه در يك بطري يا لوله شيشه‌اي گذاشت. حشرات را مي‌توان از طريق سرما دادن (فريز كردن) نيز كشت (اگر چنين امكاناتي در شرايط صحرايي وجود داشته باشد). همچنين به عنوان آخرين راهكار مي‌توان نمونه‌ها را از طريق تماس با دود سيگار كشت، اما توجه داشته باشيد در اين روش، لوازم به دود سيگار آلوده مي‌شوندو براي جمع‌آوري‌هاي بعدي حشرات به صورت زنده، بايد اين نكته را مد نظر داشت. راه ديگر براي كشتن نمونه‌ها، استفاده از گرماي شديد نور آفتاب است. لاروها را مي‌توان با انداختن در الكل كشت. افراد بالغ بندپايان كوچك را نيز مي‌توان در الكل يا به صورت مونته در لام نگهداري نمود. لاروهاي بزرگ دوبالان (مثل لارو مگس‌هاي موسيده يا كاليفوريده) را به به خوبي در آب جوش مي‌توان كشت. نمونه‌ها در آب جوش شكل خود را حفظ مي‌كنند و چروكيده نمي‌شوند. بخار حاصل از مايعات كشنده بر روي ديواره‌هاي بطري‌ها و لوله‌هاي مرگ، به ويژه در شرايط گرم نواحي گرمسيري، باقي مي‌ماند و رعايت اين نكته مهم است كه نمونه‌ها به محض مردن بايد براي سوزن زدن از شيشه مرگ خارج شوند. نمونه‌ها بايد بلافاصله پس از مرگ، اندازه‌گيري و سوزن زده شوند و يا به روش ديگري ذخيره گردند تا از چروكيده و يا شكننده شدن زياد آنها جلوگيري به عمل آيد. اين عمل به ويژه در مورد هر نمونه‌اي كه در معرض كلروفرم قرار گرفته، بايد انجام شود؛ چون اين ماده كشنده به سرعت بدن حشرات را سفت و شكننده مي‌سازد.
شيشه سم که برای کشتن حشرات جمع آوری شده مورد استفاده قرار می گيرد
سه روش اساسي نگهداري كه به صورت عمومي مورد استفاده‌اند، عبارتند از: خشك، غوطه‌ور در مايع و مونته در لام.
نگهداري به صورت خشك، براي چندين گروه از بندپايان ناقل (پشه‌ها، مگس‌هاي سياه، مگس‌هاي اسب و مگس‌هاي blowfly-) مطلوب و در برخي موارد ضروري است. اسكلت خارجي سخت بدن آنها اغلب ويژگي‌هاي مرفولوژيكي خارجي خود را حفظ مي‌كند و اين حشرات معمولاً به صورت سوزن زده شده نگهداري مي‌شوند. نمونه‌هاي بزرگ (مثل مگس اسب جنس Tabanus) را مي‌توان مستقيماً با روش‌هاي بالا مونته كرد، اما در مورد نمونه‌هاي كوچك لازم است كه اول روي يك سوزن بسيار ريز سوزن زده شوند و سپس بر روي پايه قرار گيرند. يعني نمونه‌هايي كه با سوزن‌هاي بسيار ريز سوزن زده شده اند؛ روي قطعات كوچكي از موادي از قبيل پلي‌اورتان مونته مي‌شوند و سپس اين قطعات روي يك سوزن حمل كننده بلند فيكس مي‌شوند. براي جلوگيري از خطر آسيب ديدن و شكستن، نمونه بايد در نزديكي وسط سوزن بسيار ريز فيكس شود. گاهي اوقات ديده مي‌شود كه براي مونته نمونه ابتدا سوزن بسيار ريز از پايه بلند عبور داده مي‌شود و سپس نمونه به صورت اريب روي گوشه سوزن بسيار ريز قرار مي‌گيرد. از اين روش هرگز نبايد استفاده شود. ميكروسوزن‌هاي استيل ضد زنگ در چندين اندازه و قطر مختلف، براي نمونه‌هاي با اندازه‌هاي مختلف ساخته شده‌اند. كار با چنين سوزن‌هايي توسط پنس انجام مي‌شود. روش مورد استفاده براي نمونه‌هاي كوچك، چسباندن آنها به قطعات كارت است. از به كار بردن سلولوئيد و يا ساير مواد بايد خودداري شود، چرا كه نمونه‌ها اغلب پس از خشك شدن ماده چسبدار از بين مي‌روند.
نمونه پشه مونته شده
بلوک مخصوص سوزن زدن حشرات برای استفاده در سيستم ۳ اتيکت مشخصات
نگهداري به صورت مرطوب، براي بسياري از بندپايان مهم پزشكي لازم است و براي حشرات در مرحله لاروي متداول مي‌باشد. بعضي از حشرات بالغ (مثل اكتوپارازيت هايي از قبيل كك‌ها و شپش‌ها) و كنه‌ها به اين روش نگهداري مي‌شوند. در اين روش، نمونه‌ها بايد در يك مايع كه از متلاشي شدن آنها جلوگيري مي‌كند (اتيل الكل يا اتانول) قرار داده مي‌شوند. از ساير مايعات نگهدارنده مي‌توان به فرمالين و متيل الكل (متانول) اشاره كرد. با وجود اين، اولي رنگ نمونه‌ها را تغيير مي‌دهد و دومي آنها را ترد و شكننده مي‌سازد. با گذشت زمان، همه مايعات نگهدارنده باعث سفيد و بي‌رنگ شدن نمونه‌ها مي‌شوند؛ اما نگهداري آنها در تاريكي، روند اين كار را كند مي‌سازد. بسياري از انواع لوله‌ها يا ويال‌ها، براي نگهداري نمونه‌ها در اتانول مناسب هستند، اما اين ماده از همه ظروف تبخير مي‌شود؛ حتي اگر درب آن بسته شده و يا يك چوب پنبه در درب آن قرار گرفته باشد. بنابراين، بايد ويال‌ها و لوله‌ها براي امنيت در داخل يكسري جارهاي بزرگتر كه با الكل پر شده و درب آنها كاملاً بسته و درزگيري شده، قرار داده شوند.
تعدادي از بندپايان مهم پزشكي از قبيل: ميدج‌ها، پشه‌خاكي‌ها، كك‌ها و مايت‌ها بايد براي شناسايي و نگهداري طولاني مدت پس از شناسايي، به صورت لام‌هاي ميكروسكوپي مونته شوند. با وجود اين، مي‌توان آنها را به صورت موقتي در الكل هم نگهداري كرد. دو نوع اصلي از مواد مونته كننده وجود دارند:
۱-موادي كه محيط سازنده آنها آب است؛ مثل محيط‌هاي برلز و پوري.
۲- موادي كه محيط سازنده آنها حلال آلي است؛ مانند كانادا بالزام و اوپارال.
مواد مونته كننده، از نظر شاخص‌هاي انكسار نور تفاوت دارند. بدين معني كه برخي از آنها براي يك گروه از بندپايان، مناسبتر از گروه ديگر هستند. روش‌هاي مونته و تكنيك‌هاي مناسب براي هر گروه در بخش مربوط به هر يك توضيح داده شده‌اند. در صورت مونته نمونه در وضعيت و حالت صحيح، مي‌توان آن را در راحت‌ترين حالت ممكن و با حداقل اتلاف وقت مطالعه كرد و تشخيص داد.
مراقبت از كلكسيون‌هاي حاوي حشرات سوزن زده شده در برابر آفات و قارچ‌ها، به ويژه در نواحي گرمسيري ممكن است كار مشكلي باشد. براي اين كار بايد مراحلي طي شود كه اولين آنها مطمئن شدن از نگهداري نمونه‌ها در جعبه‌هايي است كه تا حد امكان در برابر نفوذ هوا عايق باشند. بدين منظور جعبه‌هاي مخصوصي ساخته شده‌اند كه توصيه مي‌كنيم از آنها استفاده گردد. كيپ بودن درب اين جعبه‌ها، مانع از ورود آفات به داخل جعبه و از بين رفتن نمونه‌ها مي‌شود. آغشتن جعبه با قارچ‌كش (مثل مرتيولات) معمولاً براي جلوگيري از كپك زدن نمونه كافي است، اما براي حفاظت بيشتر در مكان‌هاي به شدت نمور و مرطوب، هر جعبه نگهداري را مي‌توان به صورت محكم و كاملاً عايق، در يك جعبه پلاستيكي حاوي مقداري سيليكاژل پيچيد. يك حشره‌كش (از قبيل ديكلرووس) كه در جعبه‌اي در داخل يك بلوك پلاستيكي كه در قسمتي از جعبه ثابت شده، پاشيده مي‌شود؛ مي‌تواند بسيار مؤثر باشد. اما اين كار بايد به صورت مرتب تكرار گردد.
نمونه ای از يک جعبه نگهداری نمونه در کلکسيون حشرات
اطلاعات مربوط به نمونهنمونه‌هاي فاقد برچسب ارزشي ندارند. بنابراين هر نمونه بايد داراي برچسب‌هايي كه اطلاعات مربوط به محل و زمان صيد نمونه، و ميزبان (در مورد اكتوپارازيت‌ها) در آن درج شده، باشد.
اطلاعات جغرافيايي، بايد شامل كشور، بخش كشور (استان، ناحيه يا شهرستان)، جهت‌يابي با ذكر خصوصياتي از قبيل نام روستا، رودخانه، ارتفاع محل و … باشد.
اطلاعات برچسب بايد ارائه كننده تاريخ صيد بر حسب روز، و همراه نمونه باشند. يعني به سوزني كه نمونه خشك مونته شده به آن متصل است، الصاق گردند؛ يا در زير ويال‌ها (در مورد نمونه‌هايي كه به صورت مايع نگهداري مي‌شوند) قرار گيرند و اگر نمونه‌ها به صورت لام ميكروسكوپي مونته شده باشند، به لام‌ها چسبانده مي‌شوند.
اتيکت حاوی اطلاعات نمونه حشره مونته شده که در کلکسيون نگهداری می شود
ارسال نمونه‌ها از طريق پست
در صورتي كه براي تشخيص نمونه نياز به يك متخصص باشد، و يا براي ساير مقاصد، از قبيل ارسال نمونه براي قرار گرفتن در يك كلكسيون مرجع، مي‌خواهيد آن را از طريق پست ارسال نماييد؛ نياز به بسته‌بندي خاصي مي‌باشد. متأسفانه بسياري از نمونه‌ها به صورت شكسته شده يا با خسارت‌هاي غير قابل جبران به مقصد مي‌رسند. اين امر تقريباً بيشتر به خاطر بسته‌بندي نادرست و ضعيف آنها مي‌باشد، تا به خاطر اهمال و بي‌دقتي در سرويس‌هاي پستي. از خسارت ديدن نمونه مي‌توان با رعايت احتياطات ساده‌اي جلوگيري به عمل آورد.
نمونه‌هاي موجود در مايعات بايد در داخل ويال‌هاي پلاستيكي يا شيشه‌اي كه داراي يك درب پيچ‌دار هستند، ارسال شوند (مثلاً لوله‌هايي كه در كشت انگل و ميكروبيولوژي كاربرد دارند)، و نبايد در لوله‌هايي كه با چوب پنبه يا قطعات پلاستيكي مسدود شده‌اند، قرار گيرند. در صورتي كه ويال‌هاي شيشه‌اي به دقت بسته‌بندي شوند، امنيت آنها به اندازه انواع پلاستيكي است، اما از هر نوعي كه استفاده مي‌شود، درپوش‌هايشان بايد با چسب بسته شوند، تا خطر تراوش مايع و خشك شدن محتويات لوله كاهش يابد. از ظروف چوبي توخالي موجود در بازار مي‌توان براي پست كردن ويال‌هاي با اندازه‌هاي مختلف، استفاده نمود. هر ويال بايد در داخل اين لوله‌ها با نوارهاي دستمال كاغذي كه در اطراف آن چپانده مي‌شود، در جاي خودش فيكس شود تا نمونه‌ها در حين انتقال تكان نخورند و بدن آنها متلاشي نشود.
براي ارسال پستي حشراتي كه به صورت خشك سوزن زده شده‌اند، بايد آنها را در يك جعبه محكم و تانشو، لاستيكي يا چوبي كه آن هم به نوبه خود در يك كارتن بزرگتر قرار مي‌گيرد، بسته‌بندي كرد. تقريباً همه خسارتي كه به نمونه‌هاي سوزن زده شده در پست وارد مي‌شود، در اثر فقدان يا ضخامت كم و ناكافي بسته‌بندي اطراف آنها و جعبه محتوي نمونه مي‌باشد. حداقل ضخامت 8 سانتيمتر از ماده بسته‌بندي نرم (مثل پلاستيك حباب‌دار)، يا پشم چوب بايد در اطراف هر سطحي حتي يك جعبه نمونه كوچك، و بيشتر براي جعبه‌هاي ذخيره بزرگ مورد استفاده قرار گيرد. فضاي بين نمونه‌هايي كه به صورت سوزن زده شده ارسال مي‌شوند، بايد طوري تنظيم شود كه اگر نمونه‌ها به صورت تصادفي در حين حمل و نقل بچرخند، با يكديگر برخورد نكنند. يك قطعه پنبه بايد در گوشه جعبه قرار داده شود تا قطعات شكسته شده بدن نمونه‌ها در آن گير كنند و به بقيه صدمه نزنند.
محتويات بسته ارسال شده، به صورت متداول روي سطح خارجي آن يا روي هر فرم لازم به صورت “ نمونه براي مطالعه علمي؛ فاقد ارزش تجاري” بايد نوشته شود. اين كار باعث مي‌شود كه در موقع بازرسي گمرك، جعبه را باز نكنند و محتويات آن آسيب نبيند.