روش‌هاي انجام مطالعات صحرايي و آزمايشگاهي بر روی پشه خاکی ها
الف) مطالعات صحرايي
1- روش‌هاي صيد و جمع‌آوري پشه‌خاكي‌هاي بالغ
1-1- صيد پشه‌خاكي به صورت زنده
از روش‌هاي صيد پشه‌خاكي‌ها به صورت زنده، مي‌توان موارد ذيل را نام برد:
الف) صيد با آسپيراتور در اماكن استراحت روزانه: ساده‌ترين روش براي صيد پشه‌خاكي‌ها به صورت زنده، جستجوي آنها به صورت فعال در اماكن استراحت روزانه آنهاست. اين اماكن مي‌تواند شامل اماكن انساني، محل‌هاي زندگي حيوانات، زير پوسته درختان يا درون شكاف‌هاي آنها، برگ‌هاي ريخته شده در زير درختان، فضاي بين يا زير صخره‌ها، درون غارها و … باشد. با تكان دادن آرام تنه‌هاي درختان و برگ‌هاي ريخته شده در اطراف آنها، پشه‌خاكي‌ها به پرواز در مي‌آيند و مي‌توان آنها را به كمك يك آسپيراتور دهاني يا دستي (كه با باتري چراغ قوه كار مي‌كند) صيد كرد. ابعاد هر يك از اجزاي تشكيل دهنده آسپيراتور بر اساس سليقه فرد جمع‌آورنده ممكن است فرق كند، اما قطر لوله بايد به اندازه‌اي باشد كه بتوان به سهولت اقدام به آسپيراتورزني نمود.
يك نوع آسپيراتور دهاني كه بسياري از محققين آن را ترجيح مي‌دهند، نوع مخزني آن است. اين دستگاه لوله قطورتري از نوع دهاني دارد. اين لوله در يك انتها مسدود شده و فقط به اندازه يك مجراي باريك كه پشه‌خاكي‌ها از آن طريق وارد مي‌شوند، باز است. اين حالت باعث مي‌شود كه خروج حشرات بسيار مشكل شود و بتوان صيد بيشتري را بدون نياز به انتقال آنها به ظروف نگهداري انجام داد. يكي از مشكلات استفاده از اين دستگاه، اين است كه حشرات غير عادي (مثل حشرات در حال جفتگيري يا آنهايي كه از نظر ظاهري با بقيه تفاوت قابل ملاحظه‌اي دارند) را نمي‌توان در حين نمونه‌گيري كنار گذاشت. پس از صيد، مخزن آسپيراتور در يك قفس نگهداري يا كاپس حاوي پشه‌خاكي‌ها خالي مي‌شود. يكي ديگر از مشكلات استفاده از اين آسپيراتورها، اين است كه تعداد زيادي از موهاي بدن پشه‌خاكي‌ها كه در حين جمع‌آوري آنها مي‌ريزد، در ديواره‌هاي داخلي بدنه آسپيراتور تجمع مي‌كند و از طريق فوت كردن (همانند آنچه كه در آسپيراتورهاي معمولي انجام مي‌شود) نمي‌توان آنها را خارج نمود. لذا اين موها توسط فرد كلكتور مكيده شده، شش‌ها و گلويش را تحريك مي‌كنند و در برخي موارد، منجر به ايجاد مشكلات تنفسي مي‌شوند. همچنين در جمع‌آوري پشه‌خاكي از اماكن استراحت، علاوه بر كار در تاريكي و شرايط مرطوب، احتمال ابتلا به عفونت‌هاي قارچي از قبيل هيستوپلاسموزيس هم وجود دارد.
شكل 1- آسپيراتور مخزني
بعضي از محققين براي صيد پشه‌خاكي‌هايي كه در اماكني مانند تنه درختان و يا در لانه‌هاي حيوانات بسر مي‌برند، از آسپيراتورهاي دستي استفاده مي‌كنند كه داراي يك فن مكنده الكتريكي هستند (مانند فن موجود در تله‌هاي نوراني). اين فن كه به يك لوله مكنده متصل شده، بر روي اماكن استراحت پشه‌خاكي‌ها حركت داده مي‌شود. در طرف ديگر فن، يك قفس ساخته شده از توري‌هاي معمولي وجود دارد. اين قفس ممكن است به صورت يك كيسه بوده و يا به اطراف يك قاب فلزي يا چوبي متصل شده باشد. نوع قاب‌دار به دليل امكان حركت پشه‌خاكي‌ها در داخل آن، بهتر است.
ب) تحريك با دود سيگار: در اين روش، يك پشه‌بند 1*2*1 متري را بالاي لانه جونده يا محل مورد نظر قرار مي‌دهند. سيگاري را روشن كرده و دود غليظ آن را وارد لانه مي‌كنند. در نتيجه، پشه‌خاكي‌ها از لانه جونده خارج شده و در پشه‌بند به دام مي‌افتند. پشه‌خاكي‌هايي را كه وارد پشه‌بند شده‌اند، با كمك آسپيراتور صيد مي‌كنند.
ج) صيد با استفاده از قفس بزرگ: قفس بزرگي به ابعاد 2*2*3 متر را قبل از غروب آفتاب روي سوراخ ورودي لانه جونده قرار مي‌دهند. وجه زيري قفس باز است. يك نفر به داخل قفس مي‌رود و به كمك آسپيراتور پشه‌خاكي‌ها را صيد مي‌كند.
د) تله نوراني: برخي از گونه‌هاي پشه‌خاكي (Ph.major, Ph.kandelakii) داراي نورگرايي مثبت هستند و مي‌توان آنها را با تله‌هاي نوراني CDC صيد كرد (شكل 2). با وجود اين، هزينه باتري مورد استفاده در اين تله‌ها زياد است و از لحاظ اقتصادي، استفاده از باتري‌هاي قابل شارژ مناسبتر خواهد بود. فاصله‌اي كه پشه‌خاكي‌ها به تله‌هاي نوراني CDC جلب مي‌شوند، كمتر از 2 متر است. صيد پشه‌خاكي‌ها و ساير حشرات خونخوار را مي‌توان با افزودن يك منبع دي‌اكسيدكربن به اين تله‌ها، از قبيل يك قطعه يخ خشك، افزايش داد. دي‌اكسيدكربن حاصله به كمك باد در محيط پراكنده مي‌شود و پشه‌خاكي‌ها را در محدوده وسيع‌تري به سمت تله جلب مي‌كند. بنابراين، افزودن يك منبع CO2 مي‌تواند از طريق افزايش منطقه صيد مؤثر يك تله نوراني، ميزان صيد را افزايش دهد. در برخي مناطق، مورچه‌ها ممكن است از عوامل تهديد كننده جدي براي اين روش باشند. چرا كه از طريق طناب‌هايي كه تله به كمك آنها آويزان شده، وارد آن مي‌شوند و حشرات صيد شده را در مدت زماني كوتاه به يغما مي‌برند. براي جلوگيري از اين كار مي‌توان اين طناب‌ها را با مواد دوركننده يا چسبنده آغشته نمود تا از عبور و مرور مورچه‌ها بر روي آن جلوگيري شود.
يكي از قابليت‌هاي نامطلوب تله‌هاي نوارني اين است كه بيشتر افراد ماده برخي از گونه‌هاي پشه‌خاكي را صيد مي‌كنند. اگر چه تله‌هاي نوراني در صيد تعداد زياد برخي از گونه‌هاي خاص و اندازه‌گيري تغييرات نسبي در فراواني آنها در طول زمان و همچنين در يك فضاي معين، مفيد هستند، اما در مطالعه اكولوژي پشه‌خاكي‌ها ارزش محدودي دارند. در واقع تله‌هاي نوراني براي مطالعه اختصاصي مناسب هستند.
شكل 2- تله نوراني CDC
هـ) تله‌هاي شانون: نوعي تله نوراني است كه از يك سري ورقه‌هاي سفيد عمودي با يك جعبه كم عمق ساخته شده كه با استفاده از نور و طعمه انساني و يا حيواني، پشه‌خاكي‌ها را به خود جلب مي‌كند. اين تله‌ها را در بالاي حفره لانه حيوانات قرار مي‌دهند. اين قدرت جذب لانه‌ها را به عنوان محل استراحت پشه‌خاكي‌ها از طريق خود لانه‌ها ارزشيابي مي‌كند. تله شانون براي صيد تعدادي از گونه‌هاي نئوتروپيكال در برزيل مناسب تشخيص داده شده است. پشه‌خاكي‌هاي به دام افتاده، توسط يك فرد از داخل تله جمع‌آوري مي‌شوند.
و) تله‌هاي طعمه‌اي: پشه‌خاكي‌هاي آنتروپوفيل (انسان دوست) معمولاً موقعي صيد مي‌شوند كه براي گزش انسان به اماكن زندگي وي مي‌آيند. گاهي اوقات اين روش خطرناك است و بسياري از محققين در اثر گزش پشه‌خاكي‌هاي آلوده، به ليشمانيوز مبتلا مي‌شوند. با وجود اين، روش مذكور براي شناسايي گونه‌هايي كه معمولاً از انسان خونخواري مي‌كنند، حائز اهميت است.
ز) تله‌هاي ونتاكسياي بزرگ (Ventaxia): از اين تله‌ها براي مطالعه پشه‌خاكي‌هايي كه در سطح زمين (نواحي جنگلي) حركت مي‌كنند، استفاده شده است. اين تله‌ها از يك فن بزرگ 23 سانتيمتري كه روي يك قاب نصب شده و به صورت افقي در بالاي زمين قرار مي‌گيرد، تشكيل شده‌اند. يك قيف مسي به قسمت خروجي فن متصل شده و پشه‌خاكي‌ها را به داخل قفسي كه در انتهاي آن وجود دارد، هدايت مي‌كند. اين تله‌ها براي جمع‌آوري پشه‌خاكي‌هايي كه در جستجوي ميزبان به پرواز در مي‌آيند و همچنين در مطالعه بر روي محدوده جلب تله‌هاي نوراني CDC مينياتوري به كار مي‌رود.
ح) تله‌هاي قيفي: اين تله‌ها متشكل از يك قيف هستند كه در انتهاي باريكش به يك محفظه پلاستيكي يا شيشه‌اي متصل مي‌شود. انتهاي گشاد قيف بر روي سوراخ لانه جوندگان قرار مي‌گيرد. پشه خاكي‌ها از طريق قيف وارد محفظه انتهايي مي‌شوند و به دام مي‌افتند.
در نوع ديگري از اين تله‌ها كه به تله‌هاي قيفي معروفند، از حيواناتي مانند اسب يا الاغ به عنوان طعمه استفاده مي‌شود. اين نوع تله قيفي متشكل از چادر بزرگي است كه از توري‌هاي ريزي ساخته شده و پشه‌خاكي‌ها به واسطه دما، دي‌اكسيدكربن و بوي بدن ميزبان به سمت تله جلب مي‌شوند. آنها از طريق قيف‌هاي بزرگي كه منتهي به سوراخ‌هاي كوچكي هستند، وارد اين چادرها مي‌شوند. يافتن مجدد اين سوراخ‌هاي كوچك و خروج از آنها، براي پشه‌خاكي‌ها كار مشكلي است. در پايان مدت نمونه‌گيري، پشه‌خاكي‌ها را مي‌توان به كمك آسپيراتور از روي ديواره‌هاي داخلي تله صيد كرد. در بررسي ترجيح ميزباني پشه‌خاكي، استفاده از تله‌هاي طعمه‌اي نسبت به آسپيراتورزني مستقيم از روي طعمه حيواني ارجحيت دارد، زيرا ممكن است در روش آسپيراتورزني مستقيم، پشه‌خاكي‌ها به فردي كه آنها را از روي بدن حيوان جمع‌آوري مي‌كند، جلب شوند و اطلاعات به دست آمده مغشوش گردد.
ط) تله‌هاي فرموني: اين تله‌ها بر اساس استفاده از ترشحات فرموني كه توسط گرماي بدن ميزبان منتشر مي‌شوند و باعث جلب جنس مخالف مي‌گردند، ابداع شد. با وجود اين، نتايج بدست آمده از ارزيابي اين تله‌ها در شرايط صحرايي، ضعيف بودند. همچنين مشخص شد كه غلظت‌هاي بالاتر اين فرمون‌ها خاصيت دوركنندگي دارند. محدوده جلب اين مواد، حداكثر در فاصله 2 متري است.
ي) تله پشه‌بندي با استفاده از طعمه انساني: در اين مورد، يك فرد داوطلب روي تختخوابي كه در زير يك پشه‌بند ريزبافت قرار دارد، دراز مي‌كشد و روي اين مجموعه يك توري ديگر كشيده مي‌شود. اين توري در چند سانتيمتري بالاي سطح زمين قرار مي‌گيرد و اطراف آن باز است تا پشه‌خاكي‌ها بتوانند به سمت طعمه انساني حركت كنند. پشه‌خاكي‌هايي كه وارد اين مجموعه مي‌شوند، معمولاً تمايل به حركت به سمت قسمت‌هاي رويي توري ثانويه را دارند و در اين حالت مي‌توان به فواصل معين اقدام به جمع‌آوري آنها به كمك آسپيراتور نمود.
1-2- صيد پشه‌خاكي به صورت غير زنده
در روش‌هايي كه در بالا ذكر شد، پشه‌خاكي‌ها به صورت زنده صيد مي‌شوند. نكات ذيل در مورد روش‌هايي است كه به كمك آنها مي‌توان پشه‌خاكي‌ها را به صورت غير زنده صيد كرد:
الف) تله چسبان: اين تله‌ها از كاغذهاي سفيد به ابعاد 25*20 سانتيمتر آغشته به روغن كرچك كه يك چوب باريك و صاف به طول حدود 40 سانتيمتر به صورت كوك شده در آن فرو مي‌رود، ساخته شده‌اند. اين تله‌ها را مي‌توان در مناطق استراحت پشه‌خاكي‌ها در اماكن داخلي و خارجي مورد استفاده قرار داد. تله‌هاي مذكور از طريق ايجاد مانع بر سر راه حركت پشه‌خاكي‌ها عمل مي‌كنند و اين حشرات در ضمن حركت به تله مي‌چسبند. در مطالعات بر روي فون مناطق نسبتاً خشك، از اين تله‌ها استفاده مي‌شود. ميزان صيد را مي‌توان با استفاده از نور و يا دي‌اكسيدكربن افزايش داد. پشه‌خاكي‌هاي صيد شده را به كمك يك قلم مو يا سر سوزن برداشته و پس از چربي‌زدايي در استن، در اتانول 70% كنسرو مي‌كنند. در صورتي كه منظور از مطالعه، تشريح پشه‌خاكي‌ها باشد، بايد آنها را پس از برداشتن از روي تله، بر روي يك كاغذ تميز گذاشت تا روغن اضافي خود را از دست بدهند و سپس آنها را به سرم فيزيولوژي منتقل نمود.
ب) تله ديسني: اين تله متشكل از يك سيني بزرگ آغشته به روغن كرچك كه در وسط آن يك قفس حاوي حيوان براي گزش گذاشته شده، مي‌باشند. تمام اين مجموعه با يك پارچه كتاني يا پلاستيكي پوشيده شده تا آن را در برابر باران محافظت نمايد. اين تله‌ها در آمريكاي جنوبي و مركزي استفاده وسيعي دارند و بر اساس اين كه پشه‌خاكي‌ها پروازهاي كوتاه و منقطعي دارند و معمولاً به صورت مستقيم بر روي ميزبان فرود مي‌آيند، ساخته شده‌اند. چرا كه پشه‌خاكي‌ها ابتدا بر روي يكي از سطوح نزديك ميزبان فرود مي‌آيند و سپس با پروازهاي كوتاهي براي خونخواري به روي بدن وي مي‌روند. همچنين ماده‌هايي كه خونخواري كرده‌اند، با پرش‌هاي كوتاهي از ميزبان دور مي‌شوند، بنابراين آنها بر روي سطح چسبان سيني به دام مي‌افتند. پشه‌خاكي‌ها را مي‌توان به كمك يك سوزن مونته يا قلم موي ظريف نقاشي از روي سيني برداشت و در يك محلول چربي‌زدا (استن) براي زدودن روغن از سطح بدنشان قرار داد و سپس براي نگهداري به الكل 70% منتقل نمود. ميزان جمع‌آوري بايد بر اساس تعداد پشه‌خاكي صيد شده به تله در شب بيان شود. يكي از مزيت‌هاي اين تله‌ها اطلاعاتي است كه در مورد حيوانات جلب كننده پشه‌خاكي‌ها به ما مي‌دهند. اين روش براي بررسي حيوانات كوچك، مناسبتر از حيوانات بزرگ است.
ج) توتال كچ: در اين روش تمام در و پنجره‌هاي اماكن مورد بررسي، مثلاً يك اتاق، بسته مي‌شود. سپس بر روي زمين و وسايل موجود در اتاق، ملحفه‌هاي سفيدي را پهن كرده و يك حشره‌كش آئروسل داراي اثر ضربه‌اي موجود در بازار را در داخل اتاق اسپري مي‌كنند. پس از چند دقيقه، پشه‌خاكي‌ها مي‌ميرند، بر روي ملحفه‌ها مي‌افتند و مي‌توان آنها را جمع‌آوري نمود.
با وجود روش‌هاي مختلفي كه در بالا ذكر شد، روش‌هاي نمونه‌گيري براي پشه‌خاكي‌ها مناسب نيستند و بايد كارهاي زيادي در اين زمينه انجام شود تا بتوان اين روش‌ها را بهبود بخشيد؛ به طوري كه پشه‌خاكي‌هاي صيد شده از اين اماكن، نماينده فون موجود در آن منطقه باشند. از مواردي كه مطالعه آن توصيه مي‌شود، جذب نسبي طول موج‌ها و شدت‌هاي مختلف نور است. به عنوان مثال، هيچ تله‌اي براي پشه‌خاكي‌ها وجود ندارد كه از لامپ UV استفاده كند، اما بر طبق اظهارات كيليك كندريك، وي در سيني كف حشره‌كش‌هاي UV موجود در منازل عربستان، تعداد زيادي فلبوتوموس پاپاتاسي مُرده مشاهده كرده است.
2- روش صيد لارو و استخراج آن از نمونههاي خاك
در گذشته لاروهاي پشه‌خاكي‌ها را از طريق بررسي مخلوط خاك با مواد آلي به وسيله يك عدسي دستي يا بينوكولار جستجو مي‌كردند. نمونههاي خاك از زير برگ‌هاي افتاده درختان، در ميان علف‌ها، در قاعده ديوارها، از درز و شكاف‌هاي موجود در خاك و صخره‌ها و همچنين از دالان‌هاي لانه جوندگان و ساير حيوانات تهيه مي‌شدند. اين كار بسيار به كندي انجام مي‌شد و خسته كننده بود؛ چرا كه بايد مقادير زيادي از خاك، كه گاهي اوقات به بيش از يك تُن مي‌رسيد، مورد بررسي قرار مي‌گرفت. نتايج بدست آمده هم توجيه كننده اين تلاش نبودند، چرا كه فقط تعداد معدودي لارو يافت مي‌شد. در اكثر مواقع، اجزاي چسبيده به بدن لارو، آن را از نظر پنهان مي‌كردند و لاروها با مواد زمينهاي موجود در بستر زندگيشان مخلوط مي‌شدند؛ به طوري كه تشخيص آنها مشكل بود.
Mc Combie Young، Richmond و Brendish (1926) از روش شناورسازي براي جدا كردن لاروها استفاده كردند. در اين روش، نمونههاي خاك از چندين الك عبور داده مي‌شدند، به طوري كه هر الك در زير ديگري قرار مي‌گرفت و به ترتيب توري آنها ريزتر مي‌شد. نمونه عبور داده شده از آخرين الك، در محلول قند خيسانده مي‌شد. لاروها و شفيره‌هاي حشرات، پس از مدتي در سطح اين محلول شناور مي‌شدند و با عدسي‌هاي دستي يا لوپ، قابل رؤيت بودند. در هندوستان با اين روش زيستگاههاي Ph. argentipes را تعيين كردند و مشخص شد كه همه زيستگاههاي لاروي اين گونه در خارج از ساختمان‌ها، بيش از 20 متر با ساختمان فاصله نداشت. لاروها در شهرها عمدتاً در لانه‌هاي موش‌ها يافت مي‌شوند، در حالي كه در روستاها معمولاً در لانه‌هاي جوندگان اهلي نمي‌توان آنها را يافت.
Petrishcheva (1930) تخم‌هاي پشه‌خاكي را از طريق روش شناورسازي بدست آورد. او يك نمونه خاك را از لانه يك لاك‌پشت جمع‌آوري كرد، محلول Nacl را روي آن نمونه پاشيد و آنها را به خوبي مخلوط كرد. سپس اجازه داد كه اين مخلوط ته نشين گردد و تخم‌ها در سطح آن شناور شوند. او همچنين نمونههاي خاك را در ظروف بزرگ مي‌گذاشت، روي آنها آب مي‌پاشيد، مخلوط حاصله را تكان مي‌داد و همه موادي را كه در سطح آن حركت داشتند، جدا مي‌كرد. سپس اجازه مي‌داد كه مخلوط ته نشين شود و دوباره موادي را كه در سطح آن شناور مي‌شدند، جدا مي‌كرد، آب روي مخلوط را بيرون مي‌ريخت و دوباره آب تازه روي آن مي‌پاشيد و اين عمل را 3 بار و يا اغلب بيش از سه بار تكرار مي‌كرد. محلول Nacl پس از شستشو، روي مواد رسوب كرده پاشيده مي‌شد. همه حشرات كوچك، لاروها و شفيره‌هاي موجود در نمونه، پس از مدتي در سطح شناور مي‌شدند. سپس مراحل تخم، لارو و شفيره پشه‌خاكي‌ها را به سادگي تشخيص مي‌دادند. اين روش گرچه نسبتاً پر زحمت است، ولي بسيار مؤثر بوده و به كمك آن مي‌توان زيستگاهاي لاروي را يافت.
از بررسي مقادير زيادي از نمونههاي خاك جمع‌آوري شده از زمينهاي روباز در زير درختان، و رويش گياهي باغ‌ها و … مقدار كمي لارو صيد مي‌شد، در حالي كه از لانه‌هاي جونده‌اي به نام Rhombomys opimus در آسياي مركزي، تعداد زيادي لارو، شفيره و پوسته‌هاي شفيرگي بدست مي‌آمد. همچنين در لانه‌هاي جونده‌اي به نام Nesokia indica در شوروي سابق، هم تعداد نسبتاً زيادي لارو، شفيره و پوسته شفيرگي با اين روش بدست آمد.
هانسون (1961)، و روتلگ و موزر (1972)، از روش شناورسازي روي قند و تصفيه، براي جداسازي لاروهاي پشه‌خاكي از نمونههاي خاك استفاده كردند. علي‌رغم موفقيت‌هاي قابل توجه آنها، كيليك كندريك ترجيح داد كه از قيف برلز براي اين كار استفاده نمايد. اين روش را سيدي رشتي و همكاران (1972) براي جداسازي لاروهاي فلبوتوموس پاپاتاسي از نمونههاي خاك لانه جوندگان در منطقه اصفهان انجام داده‌اند. استفاده از قيف برلز كار كمتري از روش شناورسازي با محلول قند مي‌برد و تميزتر است. براي اين كار، خاك‌هاي كف لانه جوندگان صحرايي را در داخل الك‌هاي فلزي كوچك به قطر 18-16 سانتيمتر مربع كه سوراخ‌هاي ريزي (19 سوراخ در هر اينچ) دارند، مي‌ريزند. سپس الك‌ها را بر روي قيف قرار داده و مجموعه حاصل را بر روي يك ظرف شيشه‌اي حاوي آب مي‌گذارند و در انتها يك چراغ مطالعه روميزي را در فاصله 15 تا 20 سانتيمتري سطح خاك قرار مي‌دهند. لاروها از نور و گرماي حاصله فرار كرده، به داخل آب مي‌افتند و صيد مي‌شوند. حجم نمونه بستگي به نوع خاك و ميزان رطوبت آن دارد و بايد بين 100 تا 200 گرم باشد. با اين روش سه چهارم لاروهاي سن سوم و چهارم Ph.ariasi از نمونههاي خاك جداسازي شده‌اند؛ اما اين دستورالعمل براي جداسازي لاروهاي سن دوم اين گونه كارآيي بسيار كمتري داشته و براي لاروهاي سن يك كاربردي نداشت.
يك روش ديگر براي صيد لارو، تراشيدن مواد موجود در كف چهار گوشه طويله‌ها و قرار دادن آنها در حرارت معمولي اتاق (28 درجه سانتيگراد) است. در اين روش، پس از خروج لاروها از تخم، آنها را برمي‌دارند.
3- علامتگذاري، رهاسازي و صيد مجدد
اگرچه اين روش بيشتر براي تخمين اندازه جمعيت‌هاي حشرات مورد استفاده بوده است، ولي تنها به اين منظور به كار نمي‌رود. براي چنين برآوردهايي معمولاً فرض مي‌شود كه همه پشه‌خاكي‌ها براي صيد مجدد، به يك اندازه موجود هستند. يكي از مشكلات كار، اين است كه ماده‌هاي خونخورده، به مدت يك روز يا بيشتر پس از خونخواري، به استراحت مي‌پردازند. مشكل ديگر اين است كه هيچ چيز در مورد وضعيت جمعيت و پشه‌خاكي‌هاي تازه متولد شده و همچنين آنهايي كه از منطقه مورد مطالعه خارج شده‌اند، مشخص نيست.
علامتگذاري-رهاسازي و صيد مجدد، اغلب در مطالعات بر روي طول مدت چرخه گنوتروفيك پشه‌خاكي‌ها در طبيعت و همچنين روي پراكندگي پشه‌خاكي‌ها مورد استفاده قرار مي‌گيرد.
كيليك كندريك و همكاران (1986)، اين كار را با گذاشتن پشه‌خاكي‌ها در داخل يك جعبه، آغشته كردن آنها با يك پودر فلورسنت و رهاسازي مجدد آنها در فيلد انجام داده‌اند. صيد مجدد از طريق جستجوي فعال با لامپ‌هاي سيار ماوراء بنفش، تله‌هاي نوراني و با صيد از روي انسان (يا ساير حيوانات) يا به كمك تله چسبان انجام مي‌شود.
در شوروي سابق، براي نشان‌دار كردن پشه‌خاكي‌ها از ايزوتوپ كربن 14 استفاده كرده‌اند. بدين ترتيب كه سه عدد رومبوميس اوپيموس را صيد كرده و به آنها مواد حاوي كربن 14 را به صورت داخل صفاقي تزريق نموده‌اند. سپس آنها را در محل كلني‌شان رها كرده‌اند. پس از آن با دستگاههاي ردياب به جستجوي پشه‌خاكي‌هاي داراي اين ايزوتوپ راديواكتيو پرداخته‌اند.
تعداد پشه‌خاكي‌هاي رها شده كه دوباره صيد مي‌شوند، بسته به گونه و زيستگاه آنها متفاوت است. بديهي است كه اگر زمان بيشتري صرف شود و دقت بيشتري به عمل آيد، تعداد پشه‌خاكي‌هاي علامتگذاري شده بيشتري را مي‌توان پيدا كرد.
4- تست تونل باد
رايتون و همكاران (1985)، يك تونل باد را كه در داخل آن يكسري رشته‌‌هاي سيمي برق‌دار نصب شده بود، براي جستجوي پشه‌خاكي‌ها مورد استفاده قرار دادند. موقعي كه هواي داراي بوي بدن ميزبان، در پايين تونل با حداقل سرعت 5/0-3/0 متر بر ثانيه دميده شود، پشه‌خاكي‌هاي ماده به راحتي محل ورود به تونل را پيدا مي‌كنند و به تعداد زياد در مسير جريان باد به پرواز در مي‌آيند. آنها پس از برخورد با سيم‌هاي برق‌دار كشته مي‌شوند. اين پشه‌خاكي‌ها براي شناسايي و تشريح در وضعيت خوبي قرار دارند. اين روش را مي‌توان براي ساير موارد از قبيل: تست عمل فرمون‌هاي آنها در شرايط فيلد، تعداد پشه‌خاكي‌هايي كه در زمان‌ها و مكان‌هاي مختلف براي گزش انسان مي‌آيند (بدون اين كه فرد محقق در معرض آلودگي به ليشمانيوز باشد)، و مقايسه ميزان جلب ميزبان‌هاي مهره‌دار مختلف، مورد استفاده قرار داد.
ب) مطالعات آزمايشگاهي
1- روش‌هاي نگهداري، مونته و شناسايي پشه‌خاكي‌ها
براي نگهداري پشه‌خاكي‌ها چندين روش وجود دارد و انتخاب اين روش‌ها بسته به هدف مطالعه و سليقه افراد مختلف، فرق مي‌كند. پشه‌خاكي‌ها را به دليل ريزي جثه‌شان نمي‌توان بر روي سوزن‌هاي حشره‌شناسي مونته كرد. لذا اين حشرات را بر روي لام مونته مي‌كنند، به نحوي كه سر آنها جدا از بدن قرار گيرد. سر قطع مي‌شود و طوري بر روي لام قرار مي‌گيرد كه دندانه‌هاي سيباريومي و فارنكس قابل رؤيت باشند. از مايعات مختلفي براي مونته پشه‌خاكي‌ها استفاده شده است. لوئيس (1973) استفاده از محيط برلز (صمغ عربي 12گرم، اسيد استيك گلاسيال 5 ميلي‌ليتر، محلول گلوكز 50% w/w به ميزان 5 ميلي‌ليتر، آب مقطر 40-30 ميلي‌ليتر) را توصيه كرد. پس از مدتي قرار گرفتن پشه‌خاكي‌ها در اين محيط، اعضاي داخلي بدن آنها به قدري شفاف مي‌شوند، كه قابل ديدن نيستند. اين پشه‌خاكي‌ها را مي‌توان به سهولت از حالت مونته خارج كرد و با افزودن آب به محيط، ساختمان داخلي بدن آنها را قابل رؤيت ساخت. عيب محيط برلز اين است كه اگر به دقت تهيه و در يك رطوبت معين نگهداري نشود، كريستاليزه شده، تغيير رنگ داده و چسبندگي آن كاهش مي‌يابد. در شرايط صحرايي، پشه‌خاكي‌هايي را كه با روش لوئيس مونته مي‌شوند، مي‌توان در لوله‌هاي كوچك حاوي محيط برلز نگهداري كرد.
يانگ و پركينز (1984) پشه‌خاكي‌ها را در بين لايه‌هاي كاغذ، در قوطي‌هاي مخصوص دارو نگهداري مي‌كردند. لازم به ذكر است كه در شرايط مرطوب مي‌توان يك ماده جاذب رطوبت مانند سيليكاژل را در داخل جعبه‌ها قرار داد. در مرحله بعد، آنها پشه‌خاكي‌هاي صيد شده را در هيدروكسيد پتاسيم 25-10% خيسانده، در فنل شفاف كرده و در كانادا بالزام مونته مي‌كردند.
مينتر (1963) استفاده از محلول نس‌بيت (40 گرم كريستال كلرال هيدرات، 25 ميلي‌ليتر آب، 5/2 ميلي‌ليتر اسيد كلريدريك غليظ) را براي شفاف كردن پشه‌خاكي‌ها قبل از مونته كردن در صمغ كلرال توصيه كرده‌اند.
در مطالعات فون ناقلين ليشمانيوز در ايران، پشه‌خاكي‌ها پس از جمع‌آوري، در الكل اتيليك 70% كنسرو شده و پس از انتقال به آزمايشگاه به دو روش دائم و سريع مونته مي‌گردند.
1-1- مونته دائم در محيط پوري
براي اين كار از محلول پوري (صمغ عربي 8 گرم، كلرال هيدرات 70 گرم، گليسرين 5 سي‌سي، اسيد استيك گلاسيال 3 سي‌سي، آب مقطر 10 سي‌سي) استفاده مي‌شود. بدين ترتيب كه ابتدا يك قطره پوري در وسط لام قرار مي‌دهند، سپس به كمك سوزن تشريح يك عدد پشه‌خاكي را روي آن مي‌گذارند، در مرحله بعد در زير لوپ اقدام به جدا نمودن سر پشه‌خاكي كرده، اگر از جنس فلبوتوموس بود، طوري سر آن را مي‌چرخانند كه شاخك‌ها رو به بالا و قسمت زيري سر بر روي لام باشد و اگر از جنس سرژانتوميا بود، شاخك‌ها بر روي لام و قسمت زيري سر رو به بالا باشد. سپس يك لامل بر روي آن قرار مي‌دهند. پس از اتمام كار، به مدت 24 تا 72 ساعت لام را به طور افقي بر روي ريل‌هاي چوبي نگهداري مي‌كنند تا خشك شود.
1-2- مونته دائم با استفاده از سود يا پتاس
در اين روش ابتدا پشه‌خاكي‌ها را به داخل پتاس مي‌اندازند و پس از 24 تا 36 ساعت، آنها را به آب مقطر منتقل كرده و به مدت نيم ساعت در آن قرار مي‌دهند. سپس بار ديگر آن را وارد ظرف آب مقطر ديگري نموده و يك قطره اسيد استيك گلاسيال به آن اضافه مي‌كنند. در نهايت يك قطره از محيط كانادا بالزام را روي لام قرار داده و پشه‌خاكي‌ها را بعد از آبگيري، بر روي لام مونته مي‌كنند.
1-3- مونته سريع
در اين روش پشه‌خاكي‌ها را به مدت يك دقيقه در پتاس 10% جوشانده و به ظروف آب مقطر انتقال مي‌دهند. سپس آنها را در محيط لاكتوفنل مونته مي‌كنند. اين روش معمولاً موقعي استفاده مي‌شود كه فون پشه‌خاكي‌هاي منطقه مشخص باشد و منظور از مطالعه، تعيين فراواني نسبي اين گونه‌ها باشد. اين روش به علت خراب كردن بعضي از اجزاي بدن پشه‌خاكي، براي مونته دائم مناسب نيست.
لاروها و شفيره‌ها را مي‌توان در محلول Val Andre نگهداري و مطالعه كرد. تخم‌ها به صورت خشك، يا مونته در لام، بدون استفاده از حلال‌هاي آلي كه ممكن است تزئينات خارجي مومي آنها را خراب كنند، نگهداري مي‌شوند.
پشه‌خاكي‌هايي را كه تازه صيد و كشته شده‌اند، مي‌توان روي CO2 جامد يا در نيتروژن مايع نگهداري و قبل از تشريح يا مونته، آنها را گرم نمود.
1-4- روش‌هاي تشخيص
الف) استفاده از ويژگي‌هاي مرفولوژيكي
اين روش متداولترين و ساده‌ترين راه براي تشخيص پشه‌خاكي‌ها به شمار مي‌رود و عمدتاً براساس خصوصيات موجود در ضمائم سر و دستگاه تناسلي آنها صورت مي‌گيرد.
ب) تشخيص با استفاده از روش الكتروفورز
اين روش از تكنيك‌هاي بيوشيميايي است كه در تشخيص گونه‌هاي مشابه از نظر مرفولوژيكي به كار مي‌رود. استفاده از اين روش، رو به گسترش است و تا كنون در مورد بعضي از گونه‌ها كه ماده‌هاي آنها به راحتي از هم تشخيص داده نمي‌شوند، مانند فلبوتوموس پاپاتاسي و فلبوتوموس دوبسكي، فلبوتوموس پاپاتاسي و فلبوتوموس برگروتي، و همچنين براي تفكيك گونه‌هاي سمپاتريك فلبوتوموس پاپاتاسي و فلبوتوموس لانجروني و نيز گونه‌هاي سيبلينگ فلبوتوموس پديفر و فلبوتوموس آكولئاتوس از آن استفاده شده است. اين روش در مورد شناسايي گونه‌هاي سيبلينگ بسيار موفق بوده است.
ج) تشخيص بر اساس كروماتوگرافي هيدروكربن‌هاي كوتيكول
در دهه اخير از اين روش براي تفكيك گونه‌هاي هم شكل و جمعيت‌هاي جغرافيايي يك گونه از همديگر استفاده شده است. روش اخير براي بررسي تغييرات جغرافيايي در فلبوتوموس پديفر و فلبوتوموس آرژنتيپس و براي جداسازي ماده‌هاي هم شكل گونه‌هايي از جنس لوتزوميا، همچنين براي جداسازي ماده‌هاي برخي گونه‌هاي نزديك از يكديگر و تفكيك جمعيت‌هاي نيمه اهلي و وحشي فلبوتوموس آريازي كاربرد داشته است. مدت زماني كه در اين روش براي تشخيص هر پشه‌خاكي صرف مي‌شود، 24 دقيقه است.
د) تشخيص بر اساس روش PCR
كاربرد اين روش به منظور تشخيص گونه‌هاي ثابت شده و نيز تفكيك ماده‌هايي كه از نظر مرفولوژيكي مشابه هم هستند، در حال گسترش است.
در كشورهاي مديترانه‌اي، از پروب DNA براي تشخيص فلبوتوموس پاپاتاسي از گونه‌هاي مشابه استفاده شده است.
2- تشخيص نوع خونِ خورده شده
بدين منظور ابتدا پشه‌خاكي‌هاي خونخورده را جمع‌آوري كرده، سپس آنها را مي‌كُشند، سر و سه بند انتهايي بدن را جدا كرده و آنها را تشخيص مي‌دهند. سپس بقيه بدن را در يك كپسول ژلاتيني حاوي تعداد كمي كريستال خشك سيليكاژل قرار مي‌دهند. اگر نمونه خشك شده گرم نشود، مي‌توان آن را براي ماههاي زيادي بدون آسيب نگهداري كرد. كپسول‌هاي ژلاتيني حاوي پشه‌خاكي‌ها را مي‌توان از طريق پست براي مراكز آزمايشگاهي مربوطه فرستاد. كيليك كندريك، عمل گسترش خون خورده شده توسط پشه‌خاكي‌ها را روي كاغذ صافي توصيه نمي‌كند، زيرا وي معتقد است مواد موجود در آن از بين مي‌روند. اخيراً از تست‌هاي ايمنوالكتروفورز يا اليزا براي آزمايش خونِ خورده شده استفاده مي‌كنند. اين روش‌ها به علت اين‌كه قادر به تشخيص مقدار بسيار كم خون هم هستند، از مطلوبيت بيشتري برخوردارند. اما مشكلي كه وجود دارد، اين است كه آنتي سرم‌ها معمولاً نمي‌توانند بين خونِ خورده شده از حيوانات يك خانواده تفاوتي قائل شوند. با استفاده از آنتي بادي‌هاي مونوكلونال، حساسيت تست‌ها افزايش مي‌يابد. اين آنتي‌بادي‌ها، آلبومين‌هاي مهره‌داران داراي قرابت خويشاوندي بسيار نزديك به هم را نيز از يكديگر تشخيص مي‌دهند.
نتايج مربوط به شناسايي خون خورده شده توسط پشه‌خاكي‌هايي كه طيف ميزباني وسيعي دارند، را بايد با توجه به روش‌هاي نمونه‌گيري و ميزبان‌هايي كه در آن ناحيه در دسترس پشه‌خاكي بوده‌اند، تفسير نمود. ترجيح نسبي براي ميزبان‌هاي مختلف را مي‌توان با محاسبه يك نسبت جستجو تصحيح كرد. فرمول زير بيانگر اين نسبت مي‌باشد:
درصد تغذيه روي حيوان دردسترس پشه خاكي
درصدي كه آن حيوان در جمعيت موجود است
در حال حاضر، براي تعيين نوع خون خورده شده توسط پشه‌خاكي در ايران، سر و انتهاي شكم حشره ماده خونخورده را قطع كرده و بر روي يك لام مونته مي‌نمايند. سپس معده حاوي خون را بر روي كاغذ واتمن قرار داده و له مي‌كنند، مشخصات (تاريخ و محل صيد، نام فرد جمع‌آوري كننده و شماره مربوط به لام) را روي لام و كاغذ ثبت مي‌كنند، كاغذهاي واتمن را به قطعات 3-2 ميليمتري بريده و هر يك را در داخل يك پليت قرار مي‌دهند. سپس به هر پليت مقدار 50 ميكروليتر آب مقطر مي‌افزايند. بعد از 2 ساعت همين مقدار بافر را نيز اضافه مي‌كنند و بعد با محلول PBS آن را شستشو مي‌دهند. در مرحله بعد، آنتي ايمنوگلوبولين لازم را اضافه كرده و بعد از 3 ساعت مجدداً با محلول PBS مي‌شويند و در نهايت به آن سوبسترا مي‌افزايند و بر حسب رنگ توليد شده، آن را درجه‌بندي مي‌كنند.
3- تعين سن
بدين منظور پس از بيهوش كردن پشه‌خاكي، آن را در يك قطره محلول سرم فيزيولوژي قرار مي‌دهند و سر، پاها و بال‌هاي آن را جدا مي‌كنند. سپس 2 بند آخر شكمي را به دقت شكاف داده، غدد ضميمه را بيرون مي‌كشند و از روي اندازه و وضع آنها، پاروس يا نولي پاروس بودن پشه‌خاكي را تشخيص مي‌دهند. بدين ترتيب كه در افراد نولي پاروس، اين غدد شفاف و در ماده‌هاي پاروس، شيري رنگ است. با معاينه تخمدان‌ها نيز مي‌توان اين كار را انجام داد؛ به طوري كه اگر سفت باشند، پشه‌خاكي نولي پاروس و در صورتي كه شُل باشند، پاروس خواهد بود.
در مورد برخي از گونه‌هاي پشه‌خاكي، تخمين تعداد سيكل‌هاي گنوتروفيك فرد ماده را از طريق بررسي آثار موجود بر روي پايه‌هاي اواريول‌ها مي‌توان انجام داد. با وجود اين، به نظر مي‌رسد اين روش داراي يك درصد خطاي غير قابل قبول باشد. اگرچه تشخيص ماده‌هاي پاروس از نولي پاروس تقريباً آسان است، ولي اندازه كوچك بدن پشه‌خاكي‌ها استفاده از اين روش را مشكل مي‌سازد و اغلب، كار به كندي پيش مي‌رود. انجام اين كار نيازمند تمرين زياد و تشخيص علامت‌هاي هر چند كوچك موجود در تخمدان تازه تشريح شده مي‌باشد.
يووال و يوسف (1986) از روي خطوط رشد كوتيكولي، به تعيين سن پشه‌خاكي‌هاي فلبوتوموس پاپاتاسي پرداختند. مراحل انجام كار بدين ترتيب است:
· جدا كردن سر و شكم پشه‌خاكي‌هاي نر و ماده
· قرار دادن سر براي مدت 12 ساعت در محلول هيدروكسيد سديم 4% تا بافت ماهيچه‌اي آن جدا شود.
· شستشوي دقيق و كامل قفس‌سينه در آب مقطر
· شكافتن و جدا كردن بند سوم قفس‌سينه در سطح شكمي بين كوكساهاي پاهاي عقبي (جفت سوم) در زير ميكروسكوپ
· رنگ آميزي اين بند به مدت 5 دقيقه در رنگ آبي پنبه لاكتوفنل، حاوي 2/0% آبي آنيلين
· پهن كردن و گستردن كوكساها كه در آب مقطر متورم شده‌اند، انتقال آنها به گزيلل و مونته كردن آنها در كانادا بالزام
· بررسي نمونه‌ها در زير ميكروسكوپ
ميزان تشخيص صحيح با اين روش، حدود 80 % برآورد شده است. اين روش به علت مشكل بودن تشريح پشه‌خاكي‌ها و از بين رفتن حدود 30% نمونه‌ها در طي مراحل تشريح، رنگ‌آميزي و يا مونته، مقبوليت زيادي ندارد. به علاوه، تعيين خطوط رشد موجود بر روي يك نمونه به خوبي مونته شده، نياز به تجربه دارد؛ چرا كه همه آنها عمق كانوني يكساني ندارند.
اخيراً از يك ويژگي جديد، يعني وجود چين‌خوردگي‌هاي طولي در سرتاسر هر دو لبه ناحيه پوشش محفظه ژنيتال پشه‌خاكي‌هاي ماده پاروس، براي تشخيص آنها از افراد نولي پاروس (فاقد چين‌خوردگي در اين قسمت‌ها) استفاده كرده‌اند.
4- تشخيص آلودگي ليشمانيايي پشه‌خاكي‌ها و جداسازي انگل از آنها
جداسازي و تشخيص نوع انگل ليشمانيا از پشه‌خاكي‌هاي صيد شده از فيلد، يكي از مهمترين گام‌ها در معرفي يك پشه‌خاكي به عنوان ناقل است. بهترين زمان براي جستجوي پشه‌خاكي‌هاي داراي آلودگي طبيعي، موقعي است كه نسبت ماده‌هاي پاروس در جمعيت پشه‌خاكي‌ها در بيشترين مقدار خود باشد. اين زمان، موقعي نيست كه تعداد پشه‌خاكي‌ها در اوج قرار دارد؛ اما معمولاً زماني است كه جمعيت آنها به سمت انتهاي فصل فعاليت، كاهش مي‌يابد. اوج فعاليت پشه‌خاكي‌ها نشان مي‌دهد كه تعداد زيادي از ماده‌هاي نولي پاروس، اخيراً به دنيا آمده‌اند. اين افراد هرگز خونخواري نكرده و نمي‌توانند آلوده باشند.
پروماستيگوت‌هاي انگل ليشمانيا را مي‌توان در پشه‌خاكي‌هايي كه به كمك تله چسبان صيد شده‌اند، يافت. اما به نظر مي‌رسد كه اين انگل‌ها به ميزان زيادي قدرت آلوده كنندگي خود را هم در حيوانات آزمايشگاهي و هم در محيط كشت از دست مي‌دهند. بنابراين، بهتر است كه پشه‌خاكي‌ها را موقعي كه به صورت زنده صيد مي‌شوند، بدين منظور تشريح كرد.
در تشريح براي تشخيص آلودگي لپتومونايي، پس از بيهوش كردن پشه خاكي، آن را بر روي لام در يك قطره سرم فيزيولوژي قرار مي‌دهند، سر، پاها و بال‌هاي آن را جدا مي‌كنند، سپس دو بند انتهاي شكم را شكافته، يك سوزن را روي سينه گذاشته و با سوزن ديگر به آرامي 2 بند آخر بدن را بيرون مي‌كشند. اگر انتهاي خلفي شكم قطع نشود، تمامي معده و قسمتي از مري همراه آن به بيرون كشيده خواهد شد. براي يافتن لپتوموناد، بايد معده و روده خلفي، مري و سر به دقت مورد معاينه قرار گيرند؛ لذا اين قسمت‌ها را به يك طرف لام برده و روي آنها يك لامل مي‌گذارند و در زير ميكروسكوپ با درشتنمايي*40 بررسي مي‌كنند. زماني كه انگل ديده شد، چند قطره سرم فيزيولوژي را به آن افزوده و به داخل يك سرنگ استريل يك ميلي‌ليتري مي‌كشند. سپس انگل بدست آمده را به محيط كشت انتقال مي‌دهند و يا به حيوانات حساس آزمايشگاهي تلقيح مي‌كنند. سر و دو بند انتهايي شكم هم به منظور تعيين هويت پشه‌خاكي تشريح شده، مونته مي‌شود